«Цена ошибки высока». От чего зависит результат ПЦР-тестов на коронавирус

Полимеразная цепная реакция (Polymerase chain reaction, ПЦР, PCR) – искусственный процесс, в ходе которого многократно копируются определенные участки ДНК (РНК). Метод изобрёл в 1983 году американский биохимик Кэри Б. Мюллис. В 1993 году за это открытие он был удостоен Нобелевской премии.

Области применения ПЦР чрезвычайно широки. Особое место ПЦР занимает в медицинской практике. И причина этому проста: полимеразная цепная реакция делает невозможное возможным.

Диагностику ПЦР образно описывают как метод, с помощью которого можно находить иглу в стоге сена и затем строить стог из этих игл. «Иглой» является крошечный фрагмент генетического материала клеток (ДНК или РНК).

Открытие этого метода – выдающееся событие в области молекулярной биологии за последние десятилетия. Развитие метода ПЦР позволило медицинской диагностике подняться на качественно новый уровень.

Ключевые факторы, оценка значения CT, применение на практике

ПЦР в реальном времени (также известна как количественная ПЦР, real-time PCR, или qPCR) является простой и эффективной методикой количественного определения целевой последовательности ДНК в образцах. Зачастую, по причине крайней простоты освоения и выполнения данной методики, некоторые факторы, оказывающие критическое влияние на успешность метода, остаются без внимания. В этом обзоре мы рассмотрим ключевые факторы, которые необходимо учитывать при подготовке и интерпретации результатов real-time PCR.

Цены на услуги

Смотреть все цены

• Работаем без выходных
• Удобный график приема до 20:00
• Без очередей
• Опытные врачи высокой квалификации

+ 7 (495) 374-777-0

Записаться на прием

Факторы, влияющие на CT

CT-величина (англ. Threshold cycle – пороговый цикл) – это значение количества циклов реакции, при котором кривая амплификации и прямая порога чувствительности прибора пересекаются (рис. 1B). Это значение является относительным показателем содержания ДНК-матрицы в образце, так как различия в количестве молекул матрицы в начале реакции влияют на количество циклов, необходимых для поднятия уровня флуоресценции выше уровня шума. Кроме того, на абсолютное значение CT влияет множество других факторов, которые не зависят от изначального количества ДНК-матрицы в реакции. В данной статье мы обсудим самые часто встречаемые факторы, влияющие на значение CT и выясним, как правильно оценивать эффективность прохождения real-time PCR.

На рисунке 1 изображены некоторые параметры кривой амплификации. Экспоненциальная фаза на рисунке 1B соответствует линейной фазе кривой на рисунке 1C. На рисунке 1C пороговое значение должно пересекать линейный участок кривой амплификации. Значение CT обратно пропорционально количеству ДНК-матрицы в реакции, то есть чем меньшее количество ДНК-матрицы находится в реакционной смеси, тем большее количество циклов необходимо для достижения порогового количества продукта амплификации. Однако любые изменения в составе реакционной смеси или настройках детектора флуоресценции могут оказывать влияние на значение CT. Соответственно, значение CT для реакций, которые были проведены при разных условиях или в которых были использованы разные реактивы, не могут быть непосредственно сравнены друг с другом.

Рисунок 1

Рисунок 1: A: Значение Rn представляет собой отношение интенсивности флуоресценции репортерного красителя к интенсивности флуоресценции референтного красителя. Другими словами, Rn – это репортерный сигнал, нормализованный к сигналу ROXÔ. На этом рисунке ось X отображает номер цикла ПЦР, ось Y – значение Rn.

B: Значение ΔRn представляет собой разницу значений Rn и базовой линии. На этом рисунке ось X отображает номер цикла ПЦР, ось Y – значение ΔRn.

C: График кривой амплификации представлен в виде логарифмической функции Log(ΔRn) от номера цикла.

Интересно и полезно

16.11.2018

ПЦР

Полимеразная цепная реакция была вновь открыта в 1983 году Кэри Маллисом. Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. Через 7 лет после опубликования этой идеи, в 1993г., Маллис получил за неё Нобелевскую премию.
Полимеразную цепную реакцию используют для анализа индивидуальных вариаций последовательности нуклеотидов определенных локусов, для повышения эффективности клонирования целевых последовательностей изучаемых геномов и их прямого секвенирования, для детекции в организме патогенных микроорганизмов и т. п.

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований.

Принцип метода:

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

Праймеры- короткие синтетические олигонуклеотиды длиной 18—30 оснований комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.

• Термостабильная ДНК-полимераза— фермент, катализирующий реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов— Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus(Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.
• Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
• Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции.

Реакция проводится в 30-50 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий

Денатурация. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин. для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой приём называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

Отжиг. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4—5°С ниже их температуры плавления. Время стадии— 0,5—2 мин. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре).

Элонгация. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки.Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7-10 мин.

Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) растет экспоненциально, а количество «длинных» копий ДНК линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент ДНК. Через некоторое количество циклов рост количества продуктов замедляется за счет ограничения количества реагентов, наличия ингибиторов, появления побочных продуктов реакции.

ПЦР реального времени (real-time PCR)

Real-time PCR это группа методик, дающие возможность качественного анализа продуктов ПЦР в режиме реального времени по ходу проведения реакции. Основными этапами данного метода являются:

• Определение выхода продукта реакции после каждого цикла амплификации.
• Построение по этим данным кинетической кривой PCR.
• Определение относительной концентрации субстрата на основании анализа этой кривой.

Для детекции PCR-продукта используются флуоресцентные красители, обеспечивающие флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта — репортерную флуоресценцию. Механизмы ее генерации различаются в зависимости от конкретного типа real-time PCR.

Кинетическая кривая PCR в координатах «Уровень репортерной флуоресценции — цикл амплификации» имеет S-образную форму. В ней можно выделить три стадии:

• Стадию инициации (когда PCR-продукты еще не детектируется флуоресцентной меткой).
• Экспоненциальную стадию (в которой наблюдается экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от цикла PCR).
• Плато (стадию насыщения).

Возможности ПЦР
Возможности ПЦР (полимеразной цепной реакции)

Полимеразная цепная реакция, известная более как «ПЦР» не сходит с заголовков статей научных журналов с тех пор, как была открыта Кэри Б. Мюллисом в 1983 году, за что он и был удостоен Нобелевской премии. Часто её описывают как метод, с помощью которого ученые могут находить иглу в стоге сена и затем строить стог из этих игл.«Иглой» является крошечный фрагмент генетического материала, а ПЦР не только точно обнаруживает этот фрагмент, но и затем, используя естественное свойство ДНК- репликацию (размножение), делает его копии.

В течение нескольких часов с помощью ПЦР из одного фрагмента молекулы ДНК можно получить более 100 млрд. идентичных молекул.Таким образом, можно изучить генетический материал, присутствующий в крошечных количествах. Принцип этой реакции достаточно прост и теоретически для её исполнения нужны лишь пробирка, несколько реагентов и источник тепла. Препарат ДНК, который необходимо копировать, может быть чистым, а может представлять собой очень сложную смесь биологических веществ. В качестве источника ДНК подходит и биоптат ткани пациента, и одиночный человеческий волос, и капля засохшей крови, обнаруженная на месте преступления, и мозг мумии и даже тело мамонта, пролежавшего 40 000 лет в вечной мерзлоте.

Анализ генетического материала особенно актуален для медицинской диагностики и ПЦР открывает для этого новые перспективы. ПЦР — метод молекулярной диагностики, ставший для ряда заболеваний «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически.

Что же может ПЦР? Основные медицинские области применения этого метода – диагностика инфекций и наследственных заболеваний.ПЦР открывает поистине фантастические возможности анализа генома человека – выявления дефектных генов, определяющих наследственную предрасположенность к заболеваниям.Вместе с тем, интересно и обнаружение генов, несущих информацию о полезных признаках.Например, генов снижающих риск опухолевого перерождения тканей или генов, значительно уменьшающих вероятность заражение ВИЧ-инфекцией.ПЦР используется также при генетической идентификации личности, определении степени родства.Только результат анализа ДНК позволяет окончательно дать заключение о достоверности отцовства.

Но, пожалуй, самое широкое распространение метод ПЦР в настоящее время получил как метод диагностики различных инфекционных заболеваний. ПЦР позволяет выявлять этиологию инфекции даже если в пробе, взятой на анализ содержится всего несколько молекул ДНК возбудителя. ПЦР широко используется в для ранней диагностики ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов, клещевого энцефалита, туберкулеза, заболеваний, передающихся половым путем и т.д. На сегодняшний день практически нет инфекционного агента, которого нельзя было бы выявить с помощью ПЦР.

Всем известна длительность процедуры классических методов бактериологического выделения возбудителя туберкулеза: иногда подтверждение диагноза может занимать 5 –6 месяцев.Если использовать метод ПЦР, этот срок можно сократить до нескольких часов.Высокочувствительный анализ проведенный сразу после укуса клеща позволит ответить на вопрос произошло ли заражение вирусом клещевого энцефалита или боррелиозом – методы профилактики и лечения этих клещевых инфекций совершенно различны. Это лишь самые яркие примеры преимуществ данного анализа.

Важное значение метод имеет для мониторинга и оценки эффективности терапии, особенно при вирусных заболеваниях.Определение “вирусной нагрузки”, т.е. количества вирусных частиц в крови позволяет осуществить индивидуальный подбор дозы противовирусных препаратов. При помощи ПЦР удается выявить отдельные субтипы и штаммы вирусов и бактерий, обладающих повышенной устойчивостью к тем или иным лекарственным препаратам.

Говоря о несомненном прогрессивном значении метода ПЦР, его неоспоримых преимуществах, вместе с тем, следует знать и об определенных проблемах его проведения. Чрезвычайная чувствительность метода требует строго соблюдения специального технологического режима, тщательного выполнения всех этапов анализа в отдельных изолированных зонах лаборатории. Недостаточная внимательность к процедурным тонкостям влечет неизбежную контаминацию проб и появление ложноположительных результатов.

Широкое использование недостаточно отработанных тестов при диагностики урогенитальных заболеваний, к сожалению, часто приводит к неверному результату и необоснованному назначению дорогостоящей терапии, иногда оставляющей массу побочных эффектов. Таким образом, недобросовестное проведение анализа ведет к незаслуженной дискредитации метода.

С другой стороны, метод ПЦР, как и любой другой тест антигенной диагностики во многом зависит от правильности забора и транспортировки исследуемого материала. Взятая “не с того места” проба может вообще не содержать возбудителя. Особенно требовательны к условиям хранения и транспортировки РНК -содержащие вирусы: вирус ВИЧ, гепатита С, клещевого энцефалита.Если до проведения анализа пройдет более 6 часов, такие пробы должны быть обязательно подвергнуты глубокой заморозке.

Для правильной интерпретации результатов необходимо также знать, что выявление ДНК возбудителя не всегда говорит о состоянии его жизнеспособности, а также о непосредственной связи выявленного инфекционного агента с конкретным патологическим процессом.Результат ПЦР значительно увеличивает свою информативность при комплексном обследовании пациентов с дополнительным использованием других лабораторных (иммуноферментных, биохимических и др.) и клинических исследований.

Антибиотикорезистентность методом ПЦР

Сегодня при бактериальных инфекциях наиболее часто назначаются b-лактамные антибиотики, среди которых различают пенициллины (ампициллин, метициллин), цефалоспорины (цефтриаксон, цефиксим) и карбапенемы (имипенем, меропенем). Они имеют долгую историю использования, являются безопасными и эффективными против широкого спектра бактериальных возбудителей инфекций. Однако масштабное и долгосрочное использование противомикробных препаратов этого класса привело к появлению и распространению микроорганизмов, реализующих лекарственную устойчивость за счет продукции различных вариантов b-лактамаз — ферментов, разрушающих b-лактамные антибиотики, либо за счет модификации пенициллин-связывающих белков (ПСБ), являющихся мишенями действия для b-лактамных антибиотиков.

Результаты научных исследований указывают на необходимость определения чувствительности перед назначением антимикробной терапии. Знание бактериальной резистентности к антибиотикам имеет важное значение для успешной борьбы с болезнью.

Назначение несвоевременной и неадекватной терапии внутрибольничных и тяжелых инфекций увеличивает вероятность летального исхода. Поэтому очень важно на ранних стадиях заражения выявить тип антибиотикорезистентности, чтобы подобрать адекватную схему лечения и использовать наиболее эффективные антибактериальные препараты. В случае тяжелых инфекций это нужно сделать в кратчайшие сроки.

В отличие от традиционных микробиологических методов, метод ПЦР позволяет проводить идентификацию генетических детерминант резистентности микроорганизмов, в том числе сложно культивируемых бактерий, в течение 4 часов. Он отличается высокой точностью и меньшими требованиями к забору материала, не требует наличия питательных сред, дисков с антибиотиками и дополнительных реактивов. Определение антибиотикорезитентности с помощью ПЦР позволяет спрогнозировать появление устойчивости к различным группам антимикробных препаратов, а также оценить распространение резистентных штаммов на локальном и региональном уровнях. Поэтому обнаружение антибиотикорезистентности методом ПЦР является отличным дополнением к традиционному микробиологическому тестированию.

В современной клинической практике можно выделить несколько вариантов антибактериальной резистентности, приводящих к крайне серьезным социально-экономическим последствиям. К таким вариантам относятся:

• устойчивость к β-лактамным антибиотикам среди грамотрицательных бактерий, в частности Enterobacteriaceae и P.aeruginosa, связанная с продукцией β-лактамаз;
• устойчивость к гликопептидам среди Enterococcus spp.;
• устойчивость к β-лактамным антибиотикам среди Staphylococcus aureus;
• устойчивость к фторхинолонам среди грамположительных и грамотрицательных бактерий;
• устойчивость к макролидам среди Streptococcus spp.

Большинство из перечисленных вариантов обусловлено приобретением бактериями данной группы той или иной генетической детерминанты устойчивости (таблица 1), обнаружение которой возможно с помощью ПЦР.

В ООО НПФ «Литех» разработана серия ПЦР-наборов для обнаружения генетически обусловленной устойчивости микроорганизмов к антибиотикам.

Грамотрицательные бактерии, в том числе возбудители нозокомиальных инфекций, как правило, реализуют устойчивость к b-лактамным антибиотикам за счет продукции многочисленных β-лактамаз, при этом один штамм может продуцировать несколько различных ферментов. Продуцируемые бактериями ферменты различны по своей субстратной специфичности, среди них выделяют следующие типы:

• пенициллазы, гидролизующие только пенициллин и ампициллин;
• бета-лактамазы расширенного спектра действия (ESBL), гидролизующие пенициллины и цефалоспорины;
• металло-бета-лактамазы, или карбапенемазы, гидролизующие пенициллины, цефалоспорины и карбапенемы.

Генотипирование на основе ПЦР остается золотым стандартом детекции и идентификации β-лактамаз, в том числе металло-β-лактамаз.

Необходимость обнаружения генов blaSHV, blaTEM, ответственных за продукцию пенициллаз, или b-лактамаз узкого спектра действия (NSBL)

Штаммы, продуцирующие β-лактамазы узкого спектра действия (NSBL), обычно вырабатывают TEM-1 и/или SHV-1 ферменты, которые разрушают пенициллины и ранние цефалоспорины, но чувствительны к другим классам β-лактамных антибиотиков. Мутации в промоторном участке гена TEM-1 могут привести к гиперпродукции этих ферментов. Подобная гиперпродукция может обернуться устойчивостью к другим b-лактамным антибиотикам, помимо пенициллина. Точечные мутации в этих ферментах могут привести к возникновению устойчивости к ингибиторам β-лактамаз, например, сульбактаму и клавулановой кислоте. Устойчивые штаммы особенно опасны при лечении инфекций у детей, когда препаратами выбора являются пенициллины и ранние цефалоспорины. При неадекватной терапии существует риск перехода заболевания в хроническую форму.

Для обнаружения генов устойчивости к пенициллинам и ранним цефалоспоринам разработаны следующие наборы:

• Резистентность к пенициллинам – 1

Резистентность Enterobacteriaceae

и
Pseudomonas
к пенициллинам и ранним цефалоспоринам. (Гены
TEM
)

• Резистентность к пенициллинам — 2

Резистентность Enterobacteriaceae

к пенициллинам и ранним цефалоспоринам. (Ген
SHV
-не
ESBL
)

Необходимость обнаружения генов, ответственных за продукцию ?-лактамаз расширенного спектра действия (ESBL)

Среди грамотрицательных бактерий гены blaSHV, blaTEM, blaCTX и blaAMPC, встречающиеся у E. coli, K. pneumoniae и Acinetobacter spp, кодируют ?-лактамазы расширенного спектра (ESBL) и чаще всего располагаются на плазмидах. ESBL — это β-лактамазы, способные гидролизовать все пенициллины и цефалоспорины за исключением цефамицина, моксалактама и карбапенемов. Варианты blaSHV, blaTEM, устойчивые к широкому спектру антибиотиков, образовались в результате мутаций генов TEM-1 и SHV-1. Наиболее часто встречаются CTX-M — продуцирующие грамотрицательные палочки. Во всем мире отмечается, что изоляты E.coli, продуцирующие ферменты типа CTX-M (особенно CTX-M-15), являются важной причиной инфекций мочевыводящих путей и инфекций крови.

Для обнаружения устойчивости энтеробактерий к цефалоспоринам разработан набор:

• Резистентность к цефалоспоринам — 1

Резистентность Enterobacteriaceae

к цефалоспоринам. (Гены
CTX-M
)

Необходимость обнаружения генов, ответственных за продукцию металло-бета-лактамаз, или карбапенемаз

Карбапенемы, главным образом имипенем и меропенем, являются основными агентами в борьбе с грамотрицательными палочками, обладающими множественной лекарственной устойчивостью. В этой связи распространение грамотрицательных бактерий, продуцирующих карбапенемазы, представляет серьезную проблему в сфере здравоохранения. С 2009 года Национальная референсная лаборатория Германии отслеживает молекулярную эпидемиологию карбапенемаз грамотрицательных нозокомиальных патогенов. В 2011 среди 1454 бактериальных изолятов устойчивость к карбапенемам была обнаружена у 34,4% штаммов Enterobacteriaceae, 19,9% штаммов Pseudomonas aeruginosa и в 96,3% изолятов Acinetobacter baumannii.

Карбапенем-устойчивые Enterobacteriaceae резистентны почти ко всем антибиотикам и в 40% случаев приводят к смерти пациента. В США за 2009-2010 годы в 13% случаев инфекций кровотока и катетер-ассоциированных инфекций мочевыводящих путей, вызванных Klebsiella, возбудитель был устойчив к карбапенемам. Для E.coli этот показатель составил около 2%. Наиболее частыми карбапенемазами среди Enterobacteriaceae являются OXA-48, KPC и VIM-1, у Pseudomonas aeruginosa — VIM-2. Продуцирующие их гены расположены на интегронах и могут легко встраиваться в плазмиды или хромосомы. Таким образом, довольно просто происходит обмен этими генами как внутри бактериальной популяции одного вида, так и между различными видами (например, Pseudomonas может обмениваться генетической информацией как с другими Pseudomonas, так и с другими грамотрицательными палочками). Для многих ферментов (GIM, VIM, SPM и IMP) до сих пор не разработаны ингибиторы.

Распространение NDM-1 гена, кодирующего Нью-Дели металло-b-лактамазу (NDM-1) в Enterobacteriaceae, является одной из основных проблем глобального здравоохранения. Продукт гена NDM-1 способен гидролизовать практически все b-лактамные антибиотики и в сочетании с другими механизмами резистентности делает бактерию устойчивой почти ко всем антибиотикам. Первоначально плазмиды, кодирующие blaNDM-1, были обнаружены у Klebsiella pneumoniae и Escherichia coli. Посредством конъюгации плазмиды могут передаваться и другим видам. Недавно blaNDM-1 были обнаружены в Acinetobacter baumannii и Vibrio cholerae.

NDM ферменты, такие как NDM-4, сейчас эволюционируют в более каталитически активные варианты.

Инфекции крови, вызванные OXA-48-продуцирующими Enterobacteriacea, имеют плохой прогноз, поскольку часто происходит задержка между постановкой диагноза и началом адекватной терапии.

Обнаружение способности продуцировать металло-β-лактамазы различными представителями грамотрицательных бактерий, оценка масштабов встречаемости кодируемых их генов в клинических образцах важны для предотвращения распространения инфекции и проведения адекватной этиологической терапии пациентов.

Задачу обнаружения генов, кодирующих карбапенемазы, решают следующие наборы:

• Резистентность к карбапенемам — 1

Резистентность Enterobacteriaceae

и
Pseudomonas
к карбапенемам. (Гены
VIM
)

• Резистентность к карбапенемам — 2

Резистентность Enterobacteriaceae

к карбапенемам. (Гены
NDM
)

• Резистентность к карбапенемам — 3

Резистентность Enterobacteriaceae

к карбапенемам. (Гены
OXA-48
)

Грамположительные бактерии

, как правило, реализуют устойчивость к b-лактамным антибиотикам за счет модификации пенициллин-связывающих белков (ПСБ), являющихся их мишенями действия. В частности, стафилококки способны синтезировать ПСБ2а, обладающий сниженной аффинностью к пенициллинам (метициллину и оксациллину) и цефалоспоринам. Способность к продукции такого белка кодируется геном MecA, передающимся в популяции в составе мобильной хромосомной кассеты.

Золотистый стафилококк способен поражать практически любые ткани организма человека, вызывая пневмонии, сепсис, остеомиелиты, маститы, инфекции кожи и тканей, мочевыводящих путей и др. Наличие гена MecA у S. aureus обуславливает его “метициллин — резистентность” – устойчивость к цефалоспоринам, часто сопровождающуюся множественной устойчивостью к другим классам антибиотиков. Устойчивые штаммы, обозначаемые как MRSA, часто выявляются при заражении крови и осложненных инфекциях мочеполовой системы. При лечении инфекций кожи и мягких тканей, особенно в развивающихся странах, метициллин-резистентный золотистый стафилококк нельзя сбрасывать со счетов.

Для обнаружения метициллин — резистентных штаммов золотистого стафилококка предназначен набор:

• Резистентность к цефалоспоринам- 2

Резистентность S. aureus

к b-лактамным антибиотикам. (Ген
MecA
)

Гликопептидные антибиотики — ванкомицин и тейкопланин в терапии энтерококковых инфекций

Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium являются причиной 85-90% энтерококковых и третьей по частоте причиной внутрибольничных инфекций, особенно бактериемии, сепсиса у детей, эндокардита, инфекций мочевыводящих путей. Большинство больничных изолятов энтерококков устойчивы к обычным антибиотикам, устойчивость к ванкомицину достигает 40% популяции. Два гена резистентности (VanА и VanB) являются наиболее распространенными, особенно среди E. faecium. Штаммы с VanА геном устойчивы к ванкомицину и тейкопланину, штаммы с VanB устойчивы к ванкомицину, но сохраняют чувствительность к тейкопланину.

Ванкомицин-устойчивые энтерококки (VRE) являются важными этиологическими агентами внутрибольничных инфекций. Частота обнаружения VRE особенно высока в отделениях интенсивной терапии новорожденных в связи с иммунной недостаточностью у новорожденных, частым использованием антибиотиков и длительного срока госпитализации.

По данным последних публикаций метод ПЦР является наиболее быстрым и чувствительным методом для одновременного обнаружения энтерококков и определения их резистентности к ванкомицину. Среднее время проведения ПЦР и стандартного микробиологического исследования занимает 10 часов и 5 дней, соответственно.

Для выявления устойчивости энтерококков к гликопептидным антибиотикам разработан набор:

• Резистентность к гликопептидам

Резистентность E. faecalis

и
E. faecium
к ванкоминицу и тейкопланину. (Фенотипы
VanA
и
VanB
).
Использование ПЦР — наборов позволяет быстро и качественно выявлять генетически обусловленную устойчивость микроорганизмов к антибиотикам и способствует выбору адекватной лекарственной терапии.

Влияние компонентов реакционной смеси

Интенсивность флуоресценции каждой молекулы зависит от внешних факторов, к ним относятся, например, pH или концентрации солей в реакционной смеси. На рисунке 2 изображён график флуоресценции зонда TaqMan® в двух различных реакционных смесях. Обратите внимание, что интенсивность флуоресценции в реакционной смеси A выше, несмотря на одинаковую концентрацию ДНК-матрицы, зонда и красителя ROX™ в обеих смесях.

Рисунок 2

Рисунок 2: Пики флуоресценции, полученные при анализе двух разных реакционных смесей с одинаковым количеством ROX™. Различия в значении сигналов обусловлено составом реакционных смесей. На этом рисунке ось X отображает длину волны флуоресценции, ось Y – интенсивность свечения флуорофора.

В результате, значение ΔRn будет различным, это отображено на рисунке 3. Обратите внимание, что базовые линии для двух реакционных смесей различны (рисунок 3А). Различие в значении CT не отображает общую производительность реакционной системы (рисунок 3B). Реакционные смеси с эквивалентными показателями чувствительности могут иметь различные абсолютные значения CT.

Рисунок 3.

На рисунке 3 в реакционных смесях A и B была проведена амплификация гена РНКазы P человека. В обеих образцах было использовано одинаковое количество геномной ДНК. На рисунке 3A показана зависимость Rn от номера цикла и базовые линии для обеих реакций. На рисунке 3B показана зависимость значения Log (ΔRn) от номера цикла. Значение порога чувствительности (зеленая прямая) одинаково для обеих реакций. Пороговый цикл CT для реакционной смеси B (CTB) наступает раньше, чем для реакционной смеси A (CTA) при одинаковом количестве ДНК-матрицы в обеих образцах.

Пассивный референтный краситель ROX™

Величина Rn представляет собой отношение интенсивности флуоресценции красителя FAMÔ к флуоресценции красителя ROX. Таким образом, если концентрация красителя ROX будет меньше, а концентрация FAM останется неизменной, величина Rn будет выше. Это приведет к тому, что значение базовой линии станет выше, и вследствие этого, ΔRn будет меньше, что в конечном итоге приведет к другому значению CT. Различие в значениях CT при уменьшенных концентрациях ROX не является показателем увеличения чувствительности реакции, при этом могут появиться другие нежелательные последствия. Низкая концентрация ROX в реакционной смеси может привести к увеличению стандартного отклонения значения CT, как показано на рисунке 4. Чем больше стандартное отклонение, тем менее достоверны данные, особенно если есть необходимость детектировать небольшие различия концентрации целевой последовательности ДНК. (Более подробно это описано в разделе Точность).

Рисунок 4.

На Рисунке 4. В трех реакционных смесях с различным содержанием ROX™ была проведена амплификация Трансформирующего ростового фактора бета (TGF beta). На рисунке 4A изображено значение CT, на рисунке 4B изображено стандартное (среднеквадратическое) отклонение. Чем меньше концентрация ROX, тем раньше наступает пороговый цикл, но это увеличивает стандартное отклонение.

Эффективность ПЦР

Степень эффективности полимеразной цепной реакции тоже влияет на величину CT. Сравнивая серии разведений, амплифицированых в условиях низкой и высокой эффективности реакции, мы обнаружим, что кривые амплификации имеют разный угол наклона. На рисунке 5, два образца (X и Y), амплифицированые в условиях низкой и высокой эффективности реакции, показывают различные значения CT при одной и той же концентрации ДНК-матрицы. В этом примере, кривая амплификации при высокой эффективности реакции (синий график на рисунке 5) дает более низкое значение CT при высокой концентрации ДНК-матрицы, хотя она имеет более высокую чувствительность при низкой концентрации ДНК-матрицы.

Рисунок 5.

Рис. 5. Синяя стандартная кривая отображает 100% эффективность реакции (наклон -3,3). Зеленая стандартная кривая отображает 78% эффективность реакции (наклон -4). При амплификации Y молекул ДНК-матрицы в условиях низкой эффективности реакции пороговый цикл наступает раньше, чем в условиях высокой эффективности реакции. При меньшем количестве молекул ДНК-матрицы происходит наоборот – при низкой эффективности реакции пороговый цикл наступает позже, чем в условиях высокой эффективности реакции.

Эффективность ПЦР зависит от типа анализа, качества реакционной смеси и качества ДНК в образце. Как правило, эффективность реакции 90-110% считается приемлемой.

Различие в значении CT для двух образцов может достоверно свидетельствовать о различной концентрации ДНК-матрицы в этих образцах только при условии одинаковых настройках оборудования, реактивов и типа анализа. Однако, если анализ был проведен на разном оборудовании, были использованы разные реактивы, праймеры или зонды, либо реакции проводились в разных объемах – различия в значениях CT не дадут нам достоверной информации. Следовательно, абсолютные значения CT имеет смысл сравнивать только в том случае, если все условия реакции были абсолютно одинаковыми.

Основы ПЦР

Основа метода — многократное избирательное копирование (амплификация) определённого участка ДНК с целью получения такого количества генетического материала, которого будет достаточно для визуального обнаружения. При этом многократно копируется только заданный участок ДНК при условии, что он присутствует в исследуемом биоматериале.

Кроме того, исследование позволяет проводить другие манипуляции с генетическим материалом. Поэтому метод широко применяется в научных исследованиях, биологической и медицинской практике: в диагностике инфекционных и наследственных заболеваний, при выявлении мутаций, генотипировании, установлении отцовства, идентификации личности и др.

Динамический диапазон

Для того, чтобы точно оценить эффективность реакции, необходимо провести, как минимум, 3 повторения реакции при концентрации ДНК-матрицы 5 log (105 копий ДНК-матрицы на образец). Причина такой необходимости проиллюстрирована на рисунке 6. На нем отображено изменение угла наклона графика зависимости величины CT при различных градиентах разведения ДНК-матрицы (1 log и 5 log). То есть, если мы будем проводить тестирование серии разведений при концентрации 1 log, и получим показатель 100% эффективности реакции, в реальности, разброс данного показателя будет находится в диапазоне 70-170%. Делая тот же самый тест при концентрации ДНК-матрицы 5 log, потенциальный разброс будет составлять всего ± 8%. То есть, если мы получили значение, например, 94% эффективности (при концентрации 5 log), то действительная эффективность реакции будет в диапазоне 88-100%. Из этого можно сделать вывод, что определять эффективность реакции необходимо при концентрации ДНК-матрицы 5 log. Уклон графика -3,3 ± 10% свидетельствует о 100% ± 10% эффективности полимеразной цепной реакции. Более низкие значения эффективности ПЦР свидетельствуют о низкой чувствительности метода при данных условиях.

Рисунок 6.

На Рисунке 6 точный расчет эффективности реакции, сделанный на основе серии разведений ДНК-матрицы. Для двукратного разведения на 5 точках (оранжевый) потенциальный разброс значений выше, чем для десятикратного разведения на 5 точках (синий).

Значение R2

Еще одним параметром, без которого невозможно точно рассчитать эффективность реакции, является коэффициент детерминации (R2). В математической статистике этот параметр показывает, насколько точно мы можем спрогнозировать значение некой величины, зная другую. Если R2=1, тогда можно точно установить корреляцию величины X (количество ДНК-матрицы) к Y (значению CT) (рисунок 7A). Если R2=0, тогда невозможно определить корреляцию величины X к величине Y (рисунок 7B). Значение R2>0,99, в целом, обеспечивает достаточную точность определения корреляции.

Рисунок 7.

На Рисунке 7 пример расчета R2 для двух прямых. A: между x и y нет прямой корреляции. B: между x и y есть прямая корреляция.

Точность

Наиболее используемым способом расчета точности метода является вычисление стандартного отклонения (квадратный корень из вариансы). Если множество результатов имеют небольшой разброс относительно средней величины, тогда стандартное отклонение имеет малое значение, если же разброс велик, то стандартное отклонение больше.

На практике, большая выборка представляет собой распределение, близкое к нормальному. Это следствие центральной предельной теоремы, она гласит, что суммы многих независимых, одинаково распределенных случайных величин стремятся к нормальному распределению как к пределу. На рисунке 8А значения распределены таким образом, что 68% из них находятся в пределах одного стандартного отклонения, 95% – в пределах 2 стандартных отклонений, и 99,7% находится в пределах 3 стандартных отклонений.

Если эффективность ПЦР составляет 100%, то есть одно значение CT, которое находится в пределах средних значений двукратного разведения (рисунок 8B). Для того чтобы определить количество ДНК-матрицы в диапазоне двукратных разведений в 99,7% случаев, стандартное отклонение должно быть ≤0,167. Чем больше стандартное отклонение, тем меньше вероятность достоверно найти разницу между образцами. Чтобы найти разницу между образцами в диапазоне двукратных разведений в 95% случаев, стандартное отклонение должно быть ≤0,250 (рисунок 8C).

Рисунок 8.

На Рисунке 8 нормальное распределение и стандартное отклонение. На рисунке (A) показано нормальное распределение результатов анализа. Если эффективность ПЦР составляет 100%, то есть одно значение CT, которое находится в пределах средних значений двукратного разведения (образцы X и Y). Для того, чтобы точно определить значение CT для обоих образцов в 99,7% случаев, стандартное отклонение должно быть 1 CT, деленное на 6 стандартных отклонений (1/6=0.167), как показано на рисунке (B). Для того, чтобы точно определить значение CT для обоих образцов в 95% случаев, стандартное отклонение должно быть 1 CT, деленное на 4 стандартных отклонений (1/4=0.25), как показано на рисунке (C).

Чувствительность

Любая из современных систем ПЦР в реальном времени достигла такого уровня чувствительности, что стало возможно детектировать единичную копию ДНК-матрицы в образце. Чувствительность не зависит от абсолютного значения CT.

Как было сказано ранее, ключевым фактором для расчета чувствительности метода является эффективность реакции (рисунок 5). Другим важным моментом, связанным с детекцией малого количества копий ДНК является то, что распределение ДНК-матрицы будет отличаться от нормального. Вместо этого, оно будет стремиться к распределению Пуассона: то есть, если мы имеем большую выборку повторений, в каждом из которых, в среднем, по одной копии ДНК-матрицы, то, согласно распределению, в 37% образцов не будет ни одной копии, 37% будут иметь одну копию, а 18% – по две копии ДНК-матрицы (см. рисунок 9). Следовательно, для того, чтобы обеспечить достаточную достоверность детекции малого количества ДНК, необходимо проводить достаточное количество повторений, для того, чтобы обойти ограничения, связанные с распределением Пуассона.

Рисунок 9. Распределение Пуассона для малого количества копий ДНК-матрицы. Синяя кривая показывает распределение Пуассона для 3,3 пг ДНК (1 копия молекулы ДНК). Фиолетовая – распределение Пуассона для 6,6 пг ДНК (1 клетка, 2 копии молекулы ДНК).

Вывод

Вышеописанные факторы: эффективность реакции, R2, точность и чувствительность метода необходимо учитывать при сравнении результатов ПЦР анализа при различающихся условиях реакции. Для более точных результатов сравнения, все факторы, указанные в табл. 1 должны быть учтены вместе.

Вместе с тем, дополнительные виды контроля, такие как NTC (отрицательный контроль), no RT-контроль (контроль без обратной транскрипции) и контроль качества ДНК должны быть проведены для каждого анализа.

Альтернатива ПЦР-диагностике

В любом случае нужно повышать чувствительность тест-систем на основе ПЦР, заключает Алексей Чемерис, а для этого нужны другие подходы. «Надо сделать так, чтобы ложнонегативных результатов было меньше, практически исключить их», — считает он.

В обзоре, подготовленном вместе с коллегами, профессор Чемерис рассматривает преимущества и недостатки ПЦР-диагностики и других методов амплификации — копировании РНК бетакоронавирусов, к которым относится SARS-CoV-2. Теоретически весьма перспективен метод петлевой амплификации — LAMP, где используют сразу шесть или восемь праймеров.

«С одной стороны, повышается специфичность: только когда все праймеры отожгутся (сработают, распознав РНК коронавируса. — Прим. ред.), начнется амплификация, с другой — вирус мутирует и шансы, что реакция не пойдет, увеличиваются, поскольку какие бы участки генома ни выбрать, все равно вероятность мутаций больше в восьми участках, чем в двух или трех (при использовании гибридизационного зонда), достаточных для ПЦР», — объясняет исследователь.

Во время предшествующей эпидемии SARS возбудителя выявляли с помощью реакции NASBA (амплификации на основе секвенирования нуклеиновых кислот) и RCA (репликации по типу катящегося кольца). Геномный редактор CRISPR-Cas также пробуют применять для идентификации РНК нового коронавируса. Есть работы по полногеномному секвенированию любого генетического материала, находящегося в биоматериале. Метод очень чувствительный, но дорогой и долгий — занимает 20 часов. Так что в ближайшее время ПЦР с обратной транскрипцией останется самым массовым способом обнаружения коронавируса в организме.

Попробуем применить полученные знания на примере.

В фермерском хозяйстве выявили нескольких животных с симптомами африканской чумы. Как известно, заболевание это очень «коварно»: оно может проходить как и остро, так и бессимптомно. Из-за этого болезнь распространяется крайне непредсказуемо, что чревато потерей всего поголовья свиней.

Африканская чума свиней – это вирусное заболевание. Особенностью любых вирусных заболеваний является то, что в организме хозяина вирус представлен не только в виде отдельных возбудителей-вирионов, но также и в виде молекул вирусной ДНК.

Все классические методы диагностики – патологоанатомические, иммунологические и т.п. являются косвенными, и иногда невозможно своевременно выявить носителей вируса в во время инкубационного периода или бессимптомного течения болезни. В таком случае, ПЦР-диагностика является наиболее точным, чувствительными и высокоспецифичным методом диагностики. Кроме того, благодаря особенностям Real-time PCR возможно определить количественное содержание вируса у отдельно взятого животного.

Для проведения ПЦР-исследования необходимо отобрать биологический материал – это может быть как и кровь, так и ткани внутренних органов. Далее, проводят выделение и очистку ДНК.

Расшифровка результатов

Полученные результаты оценивают только индивидуально для каждого, учитывая хронические заболевания и патологии развития пациента. В основе расшифровки лежат количественные показатели патогенных микроорганизмов. Анализируя полученные данные, врач установит:

• Степень тяжести болезни;
• Стадию ее развития;
• Назначит курс лечения с учетом нужных дозировок и длительности применения лекарств.

Отрицательный результат говорит об отсутствии проявлений инфекций и вирусов. Положительный свидетельствует о наличии инфекции. Минимальные значения показателя говорят о том, что пациент является переносчиком и требует наблюдения.

Эту диагностику проводят всем с жалобами на выделения и урогенитальные симптомы.

• При планировании беременности и при постановке беременной женщины на учет;
• Перед оперативным вмешательством;
• Рекомендуется сдавать всем женщинам 1 раз в год в виду того, что инфекция может протекать скрыто.
• Перед ЭКО для исключения причин отторжения оплодотворенной яйцеклетки.
• У мужчин после отпуска, когда имелись незащищенные половые контакты.

Сдать анализы ПЦР можно в клинике в Мытищах, где работает собственная лаборатория, оснащенная современным оборудованием. Запись на консультацию к гинекологу производится по указанному телефону. Информация о ценах различных видов диагностики представлена на сайте «Лаборатории Здоровья».

Подготовка образцов

Выделение ДНК в общем случае проводят путем разрушения (лизиса) клеток, содержащихся в образце (тем самым, высвобождая в том числе и вирусную ДНК) и очистке полученного лизата от белков, жиров и углеводов. Обеспечивается это обработкой образца поверхностно-активными веществами (например, SDS) или хаотропными агентами (напр. гуанидилтиоцианатом) в присутствии протеиназ. Далее, ДНК пререносят на носитель: к лизату добавляют суспензию ионообемнных шариков, или же его пропускают через ионообменную мембрану, на которые специфически «налипают» молекулы ДНК. Носитель с прикрепленными к нему молекулами ДНК отмывают от клеточного дебриса, после чего элюируют («открепляют») ДНК, с помощью растворителя с низкой ионной силой, чаще всего MQ-водой. На выходе получается высокоочищенный раствор ДНК, пригодный для проведения анализа.

Как проходит исследование

В процессе проведения анализа материал помещают в специальный прибор, подвергают нагреву и охлаждают. Точность полученных значений зависит от правильности изменения температурного режима.

Методом ПЦР можно определить:

• ВИЧ;
• Вирусные гепатиты;
• Мононуклеоз (инфекционный);
• Цитомегаловирус;
• На ЗППП (уреаплазма);
• Герпес;
• Кандидоз;
• Туберкулез;
• Клещевой энцефалит.

В большинстве диагностических центров предлагают сдать анализ ПЦР на 12 инфекций, но возможности диагностики в «Лаборатории Здоровья» шире, поэтому возможно проведение анализа ЦПР 14 и даже на 15 инфекций.

Амплификация

На этапе ПЦР необходимо подобрать специфическую для данного возбудителя пару праймеров – они должны обеспечить амплификацию уникального для данного вируса гена/локуса. В случае, если проводят Real-time PCR, возможно определить количество ДНК вируса в образце. Однако, для того, чтобы оценка количества ДНК вируса была достоверна, необходимо соблюсти ряд условий:

Для анализа необходимо отобрать одинаковый тип и количество биоматериала у всех больных или «подозрительных» животных;

• Забор материала должен быть произведен в одно и то же время;
• Выделение ДНК из образцов должно производиться одновременно и одним и тем же методом (набором реактивов);
• ПЦР для всех образцов необходимо проводить в одинаковых реакционных смесях, на одном и том же приборе;
• Если все образцы невозможно проанализировать за один прогон, протокол анализа на приборе должен быть одним и тем же для всех образцов.

Только при соблюдении всех условий возможно получить достоверные данные.

Если же важно установить только факт наличия возбудителя заболевания у животного, данные условия не обязательны.

ПЦР в диагностике ВИЧ-инфекции

Для выявления ВИЧ-инфекции в условиях лаборатории используется серологическая диагностика — обнаружение в крови антител к ВИЧ с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Затем следует подтверждение положительных результатов анализа методом иммуноблоттинга (ИБ). Эффективность данного подхода достигает 99% и более.

Но серологическая диагностика ВИЧ-инфекции имеет ряд ограничений:

1. Неэффективность в период «серологического окна» (в первые недели после заражения антитела не выявляются по причине их отсутствия или низкой концентрации).
2. Антитела к ВИЧ длительное время выявляются у всех детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей.
3. Ложноположительные результаты ИФА из-за присутствия в крови антител к антигенам, сходным с антигенами ВИЧ.
4. Ложноотрицательные и сомнительные результаты ИФА и иммуноблоттинга (особенно у пациентов в терминальной стадии заболевания).

Поэтому анализы ПЦР при обследовании на ВИЧ-инфекцию сегодня находят всё более широкое применение. В «Методических рекомендациях о проведении обследования на ВИЧ-инфекцию» сказано: «при наличии эпидемиологических критериев, свидетельствующих о недавнем риске заражения ВИЧ для пациентов и при этом предположительно ложноположительных или ложноотрицательных результатов ИФА и ИБ, например, при обследовании детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, или пациентов в периоде «серологического окна», используется метод ПЦР, при котором обнаруживается генный материал ВИЧ». А в случае уже установленного диагноза ВИЧ-инфекции анализ методом ПЦР используется для прогноза, динамического наблюдения и мониторинга проводимой терапии.

• Вирус иммунодефицита человека качественное определение ДНК провируса, ПЦР
• Вирус иммунодефицита человека количественное определение РНК, ПЦР
• Комплексная диагностика: качественное определение РНК вируса гепатита С/ ДНК вируса гепатита В/ РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) 1 и 2 типа

В Центре молекулярной диагностики (CMD) можно сдать ПЦР-анализ на ВИЧ анонимно.